CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE UM FRAGMENTO FAB DE ANTICORPO MONOCLONAL MURINO ANTI-PBP2A DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE À METICILINA

Resumo

Introdução: Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é uma das principais bactérias multirresistentes. A resistência se deve principalmente a presença da proteína ligadora de penicilina 2a (PBP2a). Os fragmentos de anticorpos podem ser utilizados de diversas maneiras visando o controle deste patógeno; e a obtenção e purificação eficientes são fundamentais. Objetivo: Realizar a clonagem, expressão e a purificação de fragmentos do tipo Fab murino anti-PBP2a. Metodologia: Foi realizada amplificação das sequências de cadeia leve (CL) e Fd do Fab murino anti-PBP2a por PCR, e ligação das mesmas ao vetor de expressão pCDNA3.4. Após, foi realizada a transformação e clonagem em células de E. coli TOP10, com posterior purificação do material obtido. A orientação e a identidade dos genes clonados no vetor de expressão foram analisadas por sequenciamento nucleotídico. Células HEK293 foram transfectadas com as construções correspondentes a CL e Fd-His, com cultivo acompanhado durante 5 dias. A avaliação da expressão do Fab foi realizada por Western Blot (WB) e SDS-PAGE. O sobrenadante foi coletado para etapa de purificação que foi realizada através de Cromatografia Líquida de Afinidade por Íons Metálicos utilizando a coluna HisTrap™HP. O material alvo de purificação foi injetado à coluna cromatográfica sob fluxo constante de 2mL/min, com o tampão de eluição (20mM fosfato de sódio+0,5M NaCl 1M imizadol, pH 7,4) injetado em gradiente de 0-50% no fluxo de 3mL/min em 30 volumes de coluna. Resultados: Através do sequenciamento dos clones obtidos, determinou-se as construções que apresentavam os genes de CL e Fd na orientação correta para serem utilizados na transfecção. A avaliação da expressão por SDS-PAGE permitiu observar a presença da banda em torno de 50kDa no fim do cultivo (dia 5) e confirmada ser relativa ao Fab murino anti-PBP2a por WB. A purificação do fragmento resultou em uma amostra final com alta homogeneidade, observada em SDS-PAGE. Conclusão: O presente trabalho permitiu a obtenção do Fab com alta homogeneidade, fornecendo a possibilidade da utilização em estudos para avaliação de seu potencial terapêutico e diagnóstico, focando principalmente em inovações diagnósticas como o diagnóstico in situ de focos infecciosos de MRSA.