COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM CONSÓRCIO MICROBIANO

Resumo

Introdução: A prospecção de proteínas pode contribuir diretamente na investigação de processos celulares de forma ampla e sistêmica. A identificação de proteínas diferencialmente abundantes pode elucidar informações sobre a biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo, e consequentemente revelar fatores importantes ao processo de biorremediação. A base para resultados promissores em análise proteômica é a utilização de um método confiável e reprodutível de extração de proteínas. Objetivo: Em vista disso, este trabalho propõe selecionar método de extração de proteínas com maior rendimento frente à composição heterógena de microrganismos num consórcio degradador de petróleo. Material e métodos: As cepas do consórcio fúngico (A) fazem parte dos gêneros Penicilium, Aspergillus, Byssochlamys, Rhodotorula; o consórcio bacteriano (B) do gênero Pseudomonas e Stenotrophomonas; e o consórcio misto (C) com a combinação de ambos. Esses foram cultivados em meio líquido Bushnell Haas suplementado com 1% de petróleo ou glicerol a 180 rpm durante 7 dias a 30°C. Foram utilizados dois métodos de extração levando em consideração a estrutura rígida da parede celular dos fungos e, portanto, de difícil acesso ao material proteico. Método I (extração com fenol e precipitação acetato de amônio/metanol), método II (extração com NaCl/ácido clorídrico [0,6 M/0,1%] e precipitação com ácido tricloroacético a 75%). Associado aos diferentes tampões de extração, duas estratégias foram utilizadas para auxiliar na lise celular, uma foi a adição de beads de vidros (com 2 ciclos de 5 min de severa agitação alternados com gelo por 1 min). A segunda estratégia foi a submissão do material a 4 ciclos de 2 min de ultrassom (130 W, 20 KHz). As proteínas foram quantificadas com auxílio do Qubit fluorometer (Invitrogen) conforme protocolo do fabricante e visualizadas em gel SDS-PAGE a 12%. Resultados: Como resultado, esses métodos produziram diferenças significativas na quantificação de proteínas onde, A, B e C apresentaram 115,0 μg, 183,8 μg e 24 μg, respectivamente para solução com fenol e 12 μg, 10 μg e 2 μg para cloreto de sódio. A visualização de proteínas em gel mostrou maior quantidade de bandas nas amostras extraídas com fenol, corroborando com os dados de quantificação. Conclusão: A extração com fenol e precipitação em acetato de amônio/metanol e posterior homogeneização com esferas mostrou-se satisfatória em termos de quantidade e qualidade de material proteico. Assim, nossos resultados fornecem informações úteis para a seleção de métodos de extração adequados para análise proteômica de consórcio de fungos e bactérias.